期刊：Clinical and translational medicine

影响因子：7.9

伯豪技术服务：scRNA-seq

怀孕期间母婴相互作用会使母体发生微妙变化，可能体现在外周血单核细胞(PBMC)的状态中，但目前尚未构建出孕妇的PBMC图谱。母体免疫系统的稳态对妊娠成功至关重要，免疫机制失调会导致各种妊娠相关病理，早期捕捉这些变化对风险预测和缓解很重要。虽然关于胎儿母体免疫适应的机制已有广泛研究，但大多集中在局部界面，且可能无法准确反映整个妊娠期间免疫系统的变化。有证据表明妊娠会伴随母体全身循环免疫系统的改变，而细胞组学和单细胞转录组学有助于捕捉这些免疫适应的复杂性，但对PBMC中细胞相互作用和机制的详细理解仍缺乏。本研究应用单细胞RNA测序对来自136名孕妇(妊娠6至40周)和对照组的PBMC进行分析，建立转录组时钟来预测正常妊娠的孕周。确定了怀孕期间外周免疫细胞表型的重构，包括干扰素刺激基因上调、RNA剪接相关通路激活以及细胞亚群免疫活性的变化。

主要技术

scRNA-seq

研究结果

1. PBMCs样本收集及细胞类型的鉴定

为了获得妊娠期间 PBMC 的转录动态，研究人员收集了妊娠第6周 (GW6) 至 GW40的131个PBMC样本(分为妊娠早期、中期、晚期)和5个非妊娠样本作为对照组(图1 A)。过滤后共保留了198,356个细胞，根据marker基因将这些细胞被注释为NK、单核细胞、DC细胞等共18种主要细胞类型(图1B-D)。

图1

研究人员计算了不同妊娠期和不同妊娠周数各细胞类型的百分比。结果发现，除单核细胞、增殖性T细胞和浆细胞外，大多数免疫细胞类型在妊娠四个阶段之间没有显著差异。从妊娠前三个月开始，单核细胞在妊娠期间显著增加。除了增殖性T细胞在妊娠期间比非妊娠时显著增加外，大多数淋巴细胞在妊娠期间的百分比没有显著差异。几乎所有B细胞亚型在妊娠期间都会减少，但没有显著差异。浆细胞在娠前期和中期逐渐增多，在妊娠晚期减少(图 2A-C)。

图2

3. 先天免疫细胞中干扰素反应增强

为了解妊娠进展中母体体循环中先天免疫细胞的动态变化，研究人员研究了妊娠三个时期和非妊娠状态下 NK(NK 和 NK_CD56-bright)细胞的差异。与非妊娠期相比，NK(NK 和 NK_CD56-bright)细胞中上调的DEG参与了妊娠三个时期的生物学过程，包括 IFN 和病毒反应(图3A)。GO分析显示，NK细胞中上调的基因在妊娠晚期对病毒的防御反应中富集，对细胞因子产生的正向调控(图3B)。为估计每个细胞中基因集的表达水平，研究人员进行了特征分组和控制特征选择，并通过计算获得基因集得分。通过确定NK/NK_CD56 - bright细胞中两个重要GO通路的活性，发现这两个免疫反应的表达得分在妊娠期间显著增加，且随妊娠进展而升高，这表明对IFN和病毒的增强反应是全局增强的结果，而非局限于特定基因(图3C)。此外，20个IFN刺激基因(ISG)与妊娠周呈显著正相关(图3E )。STAT1和IRF9在妊娠期间逐渐增加(图3F)。ISG评分在妊娠期间也显示出逐渐增加(图3D)。这些结果表明，STAT1可能在妊娠期间激活NK/NK_CD56-bright细胞对IFN的免疫反应中发挥重要作用。

还鉴定了妊娠和非妊娠期间单核细胞中的DEG(图3G)。大多数显著的DEG在妊娠期间减少，并且与细胞趋化因子和细胞活化信号通路的正向调节有关(图3H)。参与这两种功能的DEG在妊娠期间显著减少(图3F)。进一步评估这两条GO通路(细胞趋化因子和细胞活化的正向调节)的表达水平，与非妊娠相比，这两条通路的活性在妊娠的三个时期均显著降低(图3I)，细胞活化正向调节相关的基因IL1B、CD83、NFKBIZ在怀孕期间有所减少(图3J-K)。ISG评分和I型IFN反应的免疫评分在早期达到峰值，在晚期显着下降(图3L-M)。这些结果表明，免疫抑制在怀孕期间会增加，尤其是在第九周之后。

图3

4. 妊娠期T细胞亚群的特点

研究人员进一步探索T细胞在妊娠前/中/晚期与非妊娠期转录组表达模式。结果表明，下调的DEG 主要参与妊娠期间细胞活化、T细胞活化、免疫反应激活信号转导的正向调控，而上调的DEG主要参与IFN反应、病毒反应、细胞因子产生和 RNA 剪接相关通路(图4A)。为深入了解T细胞在妊娠各阶段的激活状态、RNA剪接等反应，研究人员评估了T细胞中六个重要GO通路的表达水平，结果表明T细胞中的TCR信号通路和T细胞激活通路得分在妊娠期间显著下调(图4B-C)。对T细胞进行细胞毒性和耗竭评分，结果发现，与妊娠前相比，大多数T细胞亚群在妊娠期间的细胞毒性评分较低，但耗竭评分较高(图4D-E)。这些结果表明，T细胞活性在整个妊娠期间显著减弱，但从早期到晚期略有增强。

与非妊娠期相比，妊娠期间IFN和病毒反应显著增加，并且随着妊娠进展而增加(图4F -G)。研究人员鉴定出28个ISG，其T细胞与妊娠周数呈正相关(图4J)。因此，比较T细胞各亚群在妊娠不同阶段与非妊娠时相关受体和分子的表达水平，发现TCRs、CD3相关蛋白、共刺激受体以及LCK和CD45在妊娠期间的T细胞亚群中均显著下调(图4K -L)。选择性剪接在维持外周免疫系统中T细胞和B细胞的稳态中起着重要作用。研究还观察到，在整个妊娠期间，T细胞亚群中的RNA剪接和通过剪接体的选择性mRNA剪接通路显著上调，但随着妊娠进展，通路得分逐渐降低(图4H - 4I)。此外，编码参与选择性剪接的RNA结合蛋白的HNRNPL在T细胞中过表达，尤其是在妊娠早期，这表明选择性mRNA剪接可能在调节妊娠期间T细胞活性中起重要作用(图4M)。

图4

5. 妊娠期间B细胞活性的减弱

妊娠也与B细胞亚群的变化有关，与非妊娠期相比，妊娠期女性外周血中下调的DEG多与B细胞功能相关，在“B细胞受体信号通路”和“B细胞活化”两个功能上富集(图5A-B)。此外，许多与“信号转导通路”、“B 细胞活化”和“免疫反应”相关的基因(MS4A1、CD79B、BLNK等)在整个妊娠期间显著下调(图5C -D)。研究人员进一步评估了两个重要GO通路(B细胞受体信号通路和B细胞激活)的表达水平(图5E-F)，发现与对照组相比，妊娠期间通路得分显著降低。在妊娠早期 - 中期，B细胞和浆细胞中RNA剪接和通过剪接体的选择性mRNA剪接通路得分显著升高(图5G-H)，记忆B细胞中HNRNPL的表达也升高(图5I)，这表明选择性剪接的上调可能有助于抑制B细胞的活性。

图5

6.疫细胞间通讯的整体比较分析

接下来，研究人员进行了细胞通讯分析，结果显示妊娠期间细胞相互作用数量和强度明显降低，信号传导和免疫活动相关通路(如SELPLG、GALECTIN、MHC-II、MHC-I 等)显著下调(图6A)。还确定了 11 种参与免疫细胞通信的特定配体/受体对在妊娠期间显著降低，如与T细胞信号相关的配体/受体对(HLA-DRB1/CD4、HLA-DRA/CD4、HLA-DRB5/CD4)。值得注意的是，CD45/CD22 在多种细胞相互作用中(如B-B、CD4T-B、CD8T-B、NKT-B等)下调非常显著。CD22是B细胞表面的抑制性辅助受体，可抑制B细胞受体诱导的信号传导，CD45 可逆转这种抑制，以维持B细胞抗原受体信号传导。这表明妊娠期间B细胞信号减弱与 CD45/CD22 相互作用减弱有关。此外，单核细胞是控制TNF信号的主要影响者，TNF/TNFRSF1B 在妊娠期间显著降低，这可能导致妊娠期间单核细胞功能障碍(图6B)。细胞通讯分析强调，细胞信号通路和免疫细胞相互作用在妊娠期间减弱，免疫细胞之间的相互作用复杂且冗。

图 6

7. 机器学习识别正常妊娠的转录组时钟

研究人员利用scRNA-seq 数据建立转录组时钟来预测正常妊娠的孕周(图7A)。经过排除和插补，从131名样本的18种细胞类型中获得了14 种，每种细胞类型生成伪细胞并进行数据分割，形成训练和独立测试数据集。通过LASSO训练了14个随机森林回归模型，并通过五折交叉验证确定最优超参数。然后，将最终训练的细胞类型特异性模型应用于独立测试数据集，得到预测的孕周估计值，与孕早期超声结果比较，筛选出基于 CD8 幼稚 T 等细胞类型的前五个预测模型(图7B-D)。评估模型在早、中、晚期妊娠的预测能力，发现中期妊娠的预测更准确，其中 CD4 和 CD8 幼稚T细胞在中期预测能力最高(图7E)。之后，通过计算 SHAP 值检查五个细胞类型特异性模型的特征重要性，发现 STAT1 和 IGKC 在预测孕周时在所有五个细胞类型中都很重要(图7F)。

图7

研究结论

总的来说，该研究成功构建了涵盖整个妊娠期的孕妇外周血单核细胞(PBMC)单细胞图谱，这对于增进对孕妇PBMC组成周转的理解具有重要意义。明确了在妊娠期间，外周免疫细胞表型发生了重构，具体体现为干扰素刺激基因的上调、RNA剪接相关通路的激活以及细胞亚群免疫活性的变化。也揭示了CD8 幼稚T、CD8 细胞毒性T、CD4 幼稚T、DNT和NK细胞类型在正常妊娠期间，尤其是在中期妊娠时，具备高精度预测孕周的潜力。

参考文献：Chen D, Wang W, Wu L, Liang L, et al. Single-cell atlas of peripheral blood mononuclear cells from pregnant women. Clin Transl Med. 2022 May;12(5):e821. doi: 10.1002/ctm2.821. PMID: 35522918; PMCID: PMC9076016.